В 1908 году русский гистолог Александр Максимов (1874-1928) опубликовал статью в одном из немецких научных журналов. В своей статье ученый впервые сформулировал положение о том, что все клетки крови развиваются из одного предшественника, который имел вид лимфоцита. Этой таинственной клетке был присвоен термин stammzelle или стволовая клетка. Так началась увлекательная и длинная история череды новых открытий и попыток применения стволовых клеток в медицине.
На сегодняшний день интерес к стволовым клеткам необычайно возрос в надежде на практически неограниченные возможности.
Стволовые клетки не дифференцированны, они способны самообновляться, образовывать новые стволовые клетки, делиться посредством митоза и дифференцироваться, становясь специализированными клетками.
Стволовые клетки обладают двумя неотъемлемыми свойствами. Во-первых, эти клетки способны сохранять неизмененный фенотип после деления (способность к самообновлению). Во-вторых, все стволовые клетки обладают потентностью, то есть могут давать потомство в виде других специализированных клеток.
В соответствии со способностью к потенции стволовые клетки делятся на следующие типы:
- Титопотентные (могут дифференцироваться в клетки эмбриональных и экстраэмбриональных тканей);
- Плюрипотентные (дают начало практически всем тканям и органам, за исключением экстраэмбриональных тканей, например, плаценты). Именно из этого типа клеток развиваются 3 зародышевых листка: эктодерма, мезодерма и энтодерма. Плюрипотентные клетки обладают наибольшей потентностью. В настоящее время именно из них можно получить гемопоэтические и панкреатические клетки, нейроны, гепатоциты и кардиомиоциты. Существуют два вида плюрипотентных клеток: эмбриональные стволовые клетки и индуцированные стволовые клетки. Последние получены путем репрограммирования взрослых соматических клеток в плюрипотентные с помощью экспрессии комбинации генов. Два вида клеток обладают похожими свойствами, однако существует предположение, что в процессе репрограммирования соматических клеток для создания индуцированных плюрипотентных клеток можно получить генетически поврежденное поколение;
- Мультипотентные стволовые клетки (дают начало клеткам разных тканей, но эта способность ограничена пределами одного зародышевого листка);
- Олигопотентные клетки (дифференцируются лишь в близкие по свойствам типы клеток);
- Унипотентные клетки (могут производить один тип клеток. Их способность к самообновлению ограничена определенным количеством делений).
На сегодняшний день наибольшее применение получили плюрипотентные клетки. Именно они способны воспроизводить специализированные типы клеток или могут быть использованы для моделирования развития и детального изучения какого-либо заболевания.
Как стволовые клетки могут помочь развитию современной медицины? В настоящее время их используют для создания нейронов, клеток поджелудочной железы, остеоцитов, кардиомиоцитов и т.д. Это дает возможность более эффективного лечения заболеваний различных органов и систем.
Однако существуют и другие альтернативные способы применения стволовых клеток. Они заключаются в создании новых низкомолекулярных препаратов. Стволовые клетки могут быть использованы на всех стадиях, начиная с идентификации мишени для воздействия молекулы препарата и заканчивая исследованиями на наличие токсинов в уже созданном препарате. Более того, плюрипотентные клетки используют для создания специфичных соматических клеток с определенным генетическим набором, что позволяет более детально изучить влияние генотипа на эффективность используемого препарата.
Еще один возможный путь применения стволовых клеток заключается в создании поколения соматических клеток, характерных для какого-нибудь заболевания. Ярким примером служит использование плюрипотентных стволовых клеток у пациентов с мутацией калиевых каналов в кардиомиоцитах и, как следствие, врожденным удлиненным интервалом QT на ЭКГ. Эти отклонения становятся причиной частых сердечных аритмий у таких пациентов. Плюрипотентные стволовые клетки были дифференцированы в кардиомиоциты, которые имели такой же удлиненный потенциал действия и функционировали как у исследуемых пациентов. Были отобраны несколько молекул этих поврежденных кардиомиоцитов, чтобы понять как можно исправить электрофизиологический дефект, лежащий в основе данного заболевания.
Поколения плюрипотентных клеток используют для изучения и других заболеваний: болезни Хаттингтона, амиотрофического латерального склероза, тяжелого комбинированного иммунодефицита, юношеского сахарного диабета, спинальной мышечной атрофии. Новое применение стволовых клеток может стать надеждой для пациентов, чей диагноз еще в недалеком прошлом был равносилен тяжелому приговору.
В 2007-м на международном медицинском конгрессе в Йокагаме были представлен доклад японских специалистов из университета Токио о феноменальном научном эксперименте. Из единственной стволовой клетки, полученной из роговицы и помещенной в питательную среду, удалось вырастить новую роговицу. Затем ученым из Японии удалось вырастить зуб также из единственной клетки. Полученный зуб выглядел как естественный и имел все составляющие, включая дентин, сосуды, эмаль и т.д. Ученые трансплантировали его лабораторной мыши, у которой новый зуб полностью прижился.
Однако, несмотря на такие перспективы, от которых захватывает дух, для реализации всех возможностей стволовых клеток необходимо выполнение нескольких условий. Первое условие заключается в способности культивировать стволовые клетки in vitro одновременно с сохранением однородной культуры недифференцированных клеток. И второй обязательный параметр это постоянный контроль дифференцировки стволовых клеток in vitro в полностью функциональные и высокоспецифичные типы клеток. Существуют множество типов стволовых клеток различного происхождения и потенции, поэтому для каждого типа нужен уникальный подход.
Помимо вышеперечисленных обязательных условий нужно помнить, что полученная культура должна состоять лишь из заранее выбранного, специфического типа клеток. Дифференцировка стволовых клеток состоит из последовательных этапов со своевременным добавлением различных комбинаций факторов роста для полной имитации процессов, происходящих in vivo. Очень важно подобрать оптимальную микросреду и правильно расположить стволовые клетки в пространстве. Одна небольшая ошибка может привести к гибели всей популяции или к созданию нежизнеспособных соматических клеток. Именно поэтому очень важно создать четкие поэтапные инструкции, выполнение которых однозначно гарантировало бы создание нужных типов клеток.
Существует несколько стратегий для управления дифференцировкой стволовых клеток.
Наиболее распространенной методикой является добавление факторов роста или небольших молекул, которые влияют на определенные сигнальные пути. Например, для дифференцировки плюрипотентных клеток в клетки поджелудочной железы нужно использовать в течение 36 дней четыре разных культуральных среды. На первом этапе ученые получают развитую эндодерму, из которой затем развивается панкреатическая эндодерма. На втором этапе из панкреатической эндодермы формируются клетки внутренней и внешней секреции и в конце концов зрелые и функционирующие островковые клетки. На каждом этапе используются сложные комбинации факторов роста.
Однако, даже если абсолютно верно подобрать нужные факторы роста и добавлять их в правильной последовательности, невозможно получить 100% чистую культуру клеток. Именно поэтому от любой полученной культуры надо отсеять элементы, не предоставляющие интереса. Для этой цели ученые вводят зеленый флуоресцентный белок в аллель гена, который мы хотим получить в новом потомстве. Пока стволовые клетки подвергаются дифференцировки, ту популяцию клеток, которая не экспрессирует введенный белок, удаляют. Еще одним способом очистки популяции клеток является введение гена, придающего клетке резистентность к действию какого-либо лекарства. Затем в культуру добавляют этот препарат и клетки, не обладающие к нему резистентностью, погибают. Например, в геном эмбриональных стволовых клеток человека был введен ген, резистентный к действию неомицина. В результате полученная культура содержала 99% правильно функционирующих альвеолоцитов 2 порядка. Для сравнения ученые оценили отношение полученных альвеолоцитов 2 порядка без введения в их предшественников нужного гена. Оказалось, что содержание альвеолоцитов составляет всего 12% от общего числа клеток. Это, конечно же, была очень значительная разница. Вышеперечисленные методы являются примером 'положительной' выборки. Также существует методика 'отрицательного' отбора. Для этого нужно активировать 'гены-самоубийцы' клеток, нежелательных в выбранной популяции. Например, наиболее часто используют активацию тимидинкиназы под контролем группы специфических промоутеров (последовательность нуклеотидов, участвующая в репликации ДНК). Такой способ также позволяет удалить ненужные клетки. Метод ‘негативного' отбора особенно ценен, когда трансплантация недифференцированных стволовых клеток может стать причиной онкогенеза у реципиента.
Полное понимание состояния микросреды, в которой стволовые клетки развиваются in vivo, и точная имитация ее для развития популяции клеток in vitro также является залогом успеха. Малейшее отклонение состояния окружающей среды приводит к изменению свойств полученных клеток. Стволовые клетки находятся в экстрацеллюлярном матриксе, который передает различные сигналы в клетки через интегриновые рецепторы (рецепторы, играющие ключевую роль в контактном взаимодействии клеток с внеклеточным матриксом). Это приводит к изменению формы клеток, к их движению и экспрессии различных белков. Были использованы различные комбинации компонентов экстрацеллюлярного матрикса с добавлением факторов адгезии. Это позволило увеличить число возможных микросред до десяти тысяч. Был разработан многокамерный микрочип, который позволял проводить одновременно 1200 опытов на 240 уникальных средах. Это дало возможность для более полного сравнения микросред и их влияние на дифференцировку стволовых клеток.
Очевидно, что кроме химического любое механическое воздействие на культуру развивающихся клеток может стать роковым. Было доказано, что вязкость полиакриламидного геля, одного из компонентов экстрацеллюлярного матрикса, имеет огромное значение в дифференцировки стволовых клеток. Использование жидкой, средней и вязкой консистенции геля приводило к развитию нейронов, миоцитов и остеоцитов соответственно.
Правы те, кто считает, что стволовые клетки обладают огромным потенциалом и их правильное использование должно привести к лечению тяжелейших заболеваний, детальному изучению генетических патологий и трансплантации органов. Однако, чтобы полностью реализовать этот потенциал, должны быть усовершенствованы методы дифференцировки стволовых клеток. Основные причины, по которым лечение стволовыми клетками еще не получило всемирного применения, заключаются:
- Сложность управления и контроля дифференцировки стволовых клеток в специфические;
- Использование высокочувствительных и неустойчивых микросред. При этом, кроме микросреды нужно тщательно подобрать комбинацию используемых факторов роста;
- Отсутствие четких инструкций и определенной последовательности шагов для создания качественной популяции клеток;
- Высокая вероятность получения популяции, состоящей из большого числа нефункциональных клеток. При этом, стоит помнить, что на создание этой культуры было затрачено много времени и средств;
- Риск получения 'неочищенной’ культуры;
- Производство стволовых клеток очень дорогая технология.
- Обсуждаются также проблемы приемлемости использования стволовых клеток с этической и религиозной точек зрения.
В ближайшем будущем стволовые клетки будут и дальше находиться в центре интересов ученых, биотехнологической и фарминдустрии. Стоит надеяться, тем не менее, что возможности, которые предоставят стволовые клетки, откроют новую главу в истории медицины.